Development of In Situ Hybridization with Tyramide Signal Amplification (ISH with TSA) for Human Papillomavirus (HPV) Detection Using Biotin Labeled Universal Oligonucleotide Probe (BLOP)

Abstract

To detect HPV DNA and evaluate the HPV infected cells, In situ Hybridization with Tyramide signal amplification using a universal oligonucleotide probe was developed. The probe was designed by bioinformatics analysis and labeled with biotin by Biotin Universal Linkage System . The biotin labeled oligonucleotide probe was evaluated by dot blot hybridization using plasmid DNA templates extracted from 11 specific HPV clones. In situ Hybridization with Tyramide signal amplification was performed on Caski cell line. 3,3.-Diaminobenzidine tetrahydrochloide and Aminoethyl carbazole were used as chromogenic substrates in detection system. The results showed that the designed universal oligonucleotide probe contained 50 bps of late gene and had ? 90% specific homology to all high risk HPV. Biotin labeled oligonucleotide probe could specifically identify all HPV DNA extracted from specific HPV clones by dot blot hybridization. For HPV DNA detection and evaluation of HPV infected cells, biotin labeled oligonucleotide probe was used in In situ Hybridization with Tyramide signal amplification that performed in HPV positive cell lines. HPV DNA was detected in the nuclei of Caski cells which demonstrated single dots or punctuate signal representing integration at multiple sites. The background decreased when Aminoethyl carbazole was used as a substrate. These results suggest that biotin labeled oligonucleotide probe can be used to identify HPV DNA and evaluate the physical status of HPV in the infected cells by In situ Hybridization with Tyramide signal amplification. This biotin labeled oligonucleotide probe will be a universal probe that further applied to identify several HPV physical status in infected cells.

การศึกษานี้ทำการพัฒนาวิธีการตรวจหา HPV DNA ในเซลล์ติดเชื้อ HPV โดยสร้างโพรบหรือสายนิวคลีโอไทด์ขนาด 50 นิวคลีโอไทด์เพื่อใช้ในการตรวจหาเชื้อฮิวแมนแพบพิวโลมาไวรัสกว่า 40 ชนิดที่ก่อให้เกิดการติดเชื้อที่บริเวณอวัยวะสืบพันธุ์โดยวิธี In situ Hybridization with Tyramide signal amplification โพรบจะถูกติดฉลากด้วยสาร Biotinโดยวิธี Universal Linkage System หรือเรียก biotin labeled oligonucleotide probe และเพิ่มความไวในการตรวจโดยใช้สาร tyramide ในการทดลองครั้งนี้ได้ทำการเปรียบเทียบ substrate 2 ชนิดเพื่อใช้เป็นสารก่อเกิดสัญญาณซึ่งทำให้เกิดตะกอนสีที่ละลายน้ำเพื่อให้ตรวจพบได้ คือ substrate 3,3’-Diaminobenzidine tetrahydrochloide ซึ่งให้ตะกอนสีน้ำตาลและ substrate Aminoethyl carbazole ซึ่งให้ตะกอนสีแดง และสามารถอ่านผลได้โดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบ standard bright field microscope จากการทดสอบความจำเพาะของโพรบกับพลาสมิดของเชื้อ HPV 11 ชนิดพบว่าโพรบสามารถทำปฏิกิริยากับพลาสมิดทั้ง 11 ชนิดโดยวิธี dot blot hybridization และเมื่อนำโพรบมาทำการตรวจหา HPV DNA โดยวิธี In situ Hybridization with Tyramide signal amplification บนเซลล์เพาะเลี้ยงมะเร็งปากมดลูก Caski ที่มีการติดเชื้อ HPV type 16 พบว่าเกิดจุดขึ้นในนิวเคลียสโดยพบจุดเดี่ยวๆหลายจุด โดยจะเกิดเป็นตะกอนสีแดงเมื่อใช้ Aminoethyl carbazole และน้ำตาลเมื่อใช้ 3,3’-Diaminobenzidine tetrahydrochloide ให้เห็นบนเซลล์ที่ศึกษาซึ่งจุดที่เกิดขึ้นเป็นลักษณะที่แสดงว่าเชื้อมีการแทรกจีโนมของเชื้อเข้าสู่จีโนมของคนคือมี physical status แบบ integrated form การใช้ Aminoethyl carbazole เป็น substrate จะมี background น้อยกว่าการใช้ 3,3’-Diaminobenzidine tetrahydrochloide จากผลการทดลองนี้แสดงว่าโพรบขนาด 50 นิวคลีโอไทด์ที่ถูกสร้างขึ้นมาสามารถตรวจพบ HPV DNA ในเซลล์ติดเชื้อและวินิจฉัยภาวะหรือ physical status ของเชื้อได้โดยใช้วิธี In situ Hybridization with Tyramide signal amplification ได้ ในการศึกษานี้จึงสรุปว่า biotin labeled oligonucleotide probe น่าจะเป็น universal probe ที่สามารถนำไปตรวจหา HPV DNA อย่างไม่จำเพาะชนิด รวมทั้งภาวะการติดเชื้อในเซลล์ติดเชื้อได้