การศึกษาการจับระหว่างโปรตีนเอวิดินและสเตรปตาวิดินกับตัวชี้บอกอนุพันธ์ของไพรีนชนิดใหม่โดยเทคนิคสเปกโทรสโกปี (BINDING OF AVIDIN AND STREPTAVIDIN WITH NEW PYRENYL PROBE BY SPECTROSCOPIC TECHNIQUES)

Abstract

 บทคัดย่อ

      เอวิดินและสเตรปตราวิดินเป็นไกลโคโปรตีนที่สามารถจับกับโมเลกุลของไบโอตินได้ดี เนื่องจากค่าคงที่ในการจับของโปรตีนทั้งสองกับไบโอตินมีค่าสูง งานวิจัยนี้ได้ทำการสังเคราะห์อนุพันธ์ของไพรีนชนิดใหม่ คือ d-biotinyl-1(1-pyrene)methylamide (Py-biotin) โดยการเชื่อมต่อโมเลกุลของไพรีนกับไบโอติน และศึกษาการจับระหว่างอนุพันธ์ของไพรีน (Py-biotin) กับโปรตีนเอวิดิน และสเตรปตาวิดิน โดยใช้เทคนิคสเปกโทรสโกปี จากการศึกษาโดยการวัดค่าดูดกลืนแสง และคำนวณค่าคงที่การจับ (binding constant, K_b) ของไพไบโอติน เมื่อจับกับเอวิดิน และสเตรปตาวิดิน พบว่ามีค่าเท่ากับ 1.00x10⁶ และ 6.79x10⁵  M^-1 ตามลำดับ ค่าการดูดกลืนแสงสูงสุดที่ความยาวคลื่น 342 นาโนเมตรของไพไบโอตินจะเลื่อนไปในทิศทางที่ความยาวคลื่นเพิ่มขึ้น ประมาณ 3 นาโนเมตร ค่าการคายแสงของไพไบโอตินจะลดลงเมื่อจับกับโปรตีนเอวิดินและสเตรปตาวิดิน ความเข้มข้น 10 ไมโครโมลาร์ แสดงให้เห็นว่าส่วนที่เป็นหมู่ไพรีนในโมเลกุลไพไบโอติน จะถูกบดบังหรือยับยั้งการคายแสงโดยโปรตีนไพไบโอตินสามารถจับกับเอวิดินได้ดีกว่าสเตรปตาวิดิน ประมาณ 1.5 เท่า

Abstract

      New pyrenyl probe, d-biotinyl-1(1-pyrene)methylamide (Py-biotin), was synthesized by coupling d-biotin to 1(1-pyrene)methylamine hydrochloride. This study focuses on binding interactions between Py-biotin to avidin and streptavidin. Binding studies of Py-biotin to both proteins were investigated using spectroscopic techniques. Binding affinity of Py-biotin to proteins was resulted from absorption titration of protein to Py-biotin solution. Binding constants for Py-biotin with avidin and streptavidin were 1.00 x10⁶ and 6.79x10⁵ M^-1, respectively. The absorption spectra of Py-biotin at 342 nm undergo changes upon binding to strept(avidin) with red shifts (3 nm) of the absorption peak positions. Adding of strepavidin (0-10 µM) to Py-biotin solution resulted in the decrease of Py-biotin fluorescence intensity. This observation indicates the protection of pyrene chromophore from aqueous solution by the protein matrix. Binding affinity of Py-biotin to avidin is about 1.5 folds higher than that of Py-biotin to streptavidin.