การพัฒนาวิธีการตรวจสอบไวรัสด้วยเทคนิค RT-PCR สำหรับ Tomato brown rugose fruit virus ในเมล็ดพันธุ์มะเขือเทศและพริกเชิงการค้าของไทย

บทคัดย่อ

เชื้อ Tomato brown rugose fruit virus (ToBRFV) ซึ่งเป็นเชื้อกักกันที่สามารถเข้าทำลายมะเขือเทศและพริก อีกทั้งยังมีการเฝ้าระวังและมาตรการสุขอนามัยพืชในประเทศไทยกำหนดให้มีการตรวจสอบเมล็ดพันธุ์ที่นำเข้าหรือส่งออกไม่ให้พบเชื้อ ToBRFV ดังนั้นวิธีการตรวจสอบเชื้อ ToBRFV ในเมล็ดพันธุ์จึงมีความสำคัญยิ่ง งานวิจัยนี้ศึกษาการตรวจหาเชื้อ ToBRFV ด้วยเทคนิค reverse transcription-PCR (RT-PCR) เนื่องจากยังไม่มีการพบโรคนี้ในประเทศไทยจึงใช้ positive control เป็นพลาสมิดสายผสม pMA-RQ-REF ซึ่งมียีนเป้าหมายคือ replicase gene ขนาด 560 bp เติมลงไปในตัวอย่างอาร์เอ็นเอที่สกัดจากเมล็ดพริกและมะเขือเทศปกติ นำไปสังเคราะห์ cDNA จากนั้นตรวจสอบด้วยวิธี RT-PCR แล้ววิเคราะห์ด้วย 1% agarose gel electrophoresis ผลการตรวจสอบพบว่า วิธีการนี้มีความจำเพาะสูงร้อยละ 100 กับเชื้อไวรัส ToBRFV โดยไม่ทำปฏิกิริยากับไวรัสชนิดอื่นรวม 13 ชนิด ใน 5 จีนัส ทดสอบความไวโดยใช้ยีน replicase ที่มีความเข้มข้นเริ่มต้น 100 นาโนกรัมต่อไมโครลิตร เจือจางในน้ำกลั่นและน้ำบดเมล็ด พบว่ามีความไวถึงระดับ 1x10^-6 เฟมโตกรัมต่อไมโครลิตร และ 100 พิโคกรัมต่อไมโครลิตร ตามลำดับ เมื่อเปรียบเทียบวิธีการตรวจเชื้อ ToBRFV ด้วยวิธี RT-PCR จากงานวิจัยนี้และวิธี Real-time RT-PCR ที่วิเคราะห์โดยกลุ่มวิจัยกักกันพืช สำนักวิจัยพัฒนาการอารักขาพืช กรมวิชาการเกษตร ในตัวอย่างเมล็ดพันธุ์ทางการค้า จำนวน 245 ตัวอย่าง ซึ่งประกอบด้วยเมล็ดพันธุ์มะเขือเทศ จำนวน 71 ตัวอย่าง และเมล็ดพันธุ์พริก จำนวน 174 ตัวอย่าง พบว่าให้ผลการตรวจสอบที่ตรงกันร้อยละ 100 โดยไม่พบเชื้อ ToBRFV ในทุกตัวอย่าง